Prima di tutto, sia EcoR1 che Xba1 lasciano 5' di strapiombo quando digeriscono il DNA (come fa Nde1). In entrambi i casi l'estremità 3' è incassata motivo per cui Polyermase può aggiungere basi. In secondo luogo, tutte le polimerasi possono aggiungere basi solo a un'estremità di 3', quindi Klenow aggiungerà 4 basi all'estremità arretrata di 3' di entrambi i siti per generare estremità smussate.
Gli enzimi di restrizione lasciano un 5 fosfato?
I vettori e gli inserti digeriti dagli enzimi di restrizione contengono le necessarie modifiche terminali (5' fosfato e 3' idrossile), mentre i frammenti creati dalla reazione a catena della polimerasi (PCR) potrebbero non esserlo.
Le punte smussate possono essere legate?
Legatura dell'estremità smussata
La legatura dell'estremità smussata non implica l'accoppiamento di basi delle estremità sporgenti, quindi qualsiasi estremità smussata può essere legata a un' altra estremità smussata. Le estremità smussate possono essere generate da enzimi di restrizione come SmaI ed EcoRV.
La Taq polimerasi produce punte smussate?
Sì… Taq Polymerase aggiunge A-overhang se mantieni il passo di estensione finale a 72 dC sulla PCR. Utilizzato principalmente per la clonazione TA.
Perché usare il frammento di Klenow nel sequenziamento del DNA?
Il frammento di Klenow è estremamente utile per compiti basati sulla ricerca come: Sintesi di DNA a doppio filamento da modelli a filamento singolo . Riempendo le estremità recedute di 3' di frammenti di DNA per rendere smussato lo sbalzo di 5' . Digerire via gli strapiombi di 3 piedi.
